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食品中氯丙醇酯、縮水甘油酯測(cè)定的整體解決方案Ⅲ——第二篇第三法

更新時(shí)間:2024-04-26      點(diǎn)擊次數(shù):857

氯丙醇酯污染是國(guó)際上比較關(guān)注的食品安全熱點(diǎn)問(wèn)題之一,近些年,常有報(bào)道植物油、嬰幼兒奶粉等食品中檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯。氯丙醇酯是氯丙醇類(lèi)化合物與脂肪酸的酯化產(chǎn)物,食品中檢出量較高的是3-氯丙醇酯,在谷物、咖啡、魚(yú)、肉制品、馬鈴薯、堅(jiān)果和以植物油為原料的熱加工油脂食品中都有3-氯丙醇酯檢出;縮水甘油酯是脂肪酸與縮水甘油的酯化產(chǎn)物,它與氯丙醇酯是一對(duì)孿生兄弟,形成機(jī)理相似,在油脂精煉過(guò)程中,縮水甘油酯通常會(huì)伴隨3-氯丙醇酯一起形成,3-氯丙醇酯含量高,縮水甘油酯含量也高。

安譜實(shí)驗(yàn)參照國(guó)標(biāo)《GB 5009.191-2024 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測(cè)定》第二篇第一法和第三法,并進(jìn)行優(yōu)化,使用堿水解方法進(jìn)行酯鍵斷裂,苯基硼酸進(jìn)行衍生,氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè),內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,AB管校正縮水甘油酯含量,對(duì)嬰幼兒配方奶粉中的氯丙醇酯和縮水甘油酯的含量進(jìn)行了檢測(cè),方法回收率高,精密度好。



1、原理

稱取同一試樣兩份于 A、B 管中,加入氘代氯丙醇酯同位素內(nèi)標(biāo),用氫氧化鈉-甲醇溶液進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng),3 -氯- 1, 2-丙二醇酯(3-MCPDE)、2-氯-1, 3-丙二醇酯(2-MCPDE)和縮水甘油酯(GE)分別轉(zhuǎn)化為游離態(tài) 3-MCPD、2-MCPD、縮水甘油;試液經(jīng)中和、凈化和苯基硼酸衍生后,以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。

B 管樣品加入酸化溴化鈉溶液中和后,GE 水解生成的縮水甘油轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的 3-溴-1,2-丙二醇(3-MBPD),不影響氯丙醇酯的計(jì)算,B管用以測(cè)定試樣中 3-MCPDE、2-MCPDE 的含量;A 管樣品經(jīng)酸化氯化鈉溶液中和后,GE 水解后生成的縮水甘油主要轉(zhuǎn)化為 3-MCPD,測(cè)定得到的 3-MCPDE 值為試樣中 3-MCPDE 和縮水甘油酯(GE)之和,由 A 管和B 管 3-MCPDE 含量的差值,再乘以 3-MCPDE和GE 的折算系數(shù),得到試樣中 GE 的含量。




2、標(biāo)準(zhǔn)品

實(shí)驗(yàn)用到的標(biāo)準(zhǔn)品信息見(jiàn)下表:

表1 標(biāo)準(zhǔn)品信息

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2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(10 μg/mL):分別準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL 3-MCPDE、2-MCPDE標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中,用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存,保存期 6個(gè)月。

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL I(2 μg/mL):準(zhǔn)確移取1 mL 10 μg/mL 氯丙醇酯混標(biāo)中間液,用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存,保存期 3個(gè)月。

氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL II(0.2 μg/mL):準(zhǔn)確移取1 mL 2 μg/mL 氯丙醇酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液I,用甲苯定容至10 mL。臨用現(xiàn)配。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)中間液(10 μg/mL):準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中,用甲苯定容至刻度。于-20 ℃保存,保存期 6個(gè)月。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL I(2 μg/mL):準(zhǔn)確移取1 mL 10 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)中間液,用甲苯定容至5 mL。于-20 ℃保存,保存期 3個(gè)月。

縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液CaL II(0.2 μg/mL):準(zhǔn)確移取1 mL 2 μg/mL 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)工作液I,用甲苯定容至10 mL。臨用現(xiàn)配。

內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(D5-3-MCPDE:1µg/mL,D5-2-MCPDE:1µg/mL):分別準(zhǔn)確移取0.2 mL 50 μg/mL D5-3-MCPDE和D5-2-MCPDE標(biāo)準(zhǔn)溶液到10 mL容量瓶中,用甲苯稀釋至刻度。于-20 ℃保存,保存期 3個(gè)月。


2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

按照下表所示,分別配制氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線和縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線。加入甲苯、叔丁基甲醚(tBME)、內(nèi)標(biāo)工作溶液和相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照“樣品前處理"進(jìn)行操作,上機(jī)檢測(cè)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

(B管,加入酸性溴化鈉)

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表3 縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

(A管,加入酸性氯化鈉)

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標(biāo)準(zhǔn)品配制注意事項(xiàng):

1、氯丙醇酯濃度均以對(duì)應(yīng)的氯丙醇計(jì),縮水甘油酯濃度以縮水甘油計(jì),定量計(jì)算中需特別注意。

2、如使用純品型標(biāo)品,需注意計(jì)算標(biāo)品的純度和對(duì)應(yīng)的折算系數(shù)。建議選擇安譜璀世溶液型標(biāo)品,進(jìn)行稀釋配制,操作更加方便。

3、注意區(qū)分AB管,氯丙醇酯標(biāo)曲加入溴化鈉溶液,縮水甘油酯標(biāo)曲加入氯化鈉溶液;內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均需要加入。




3、前處理步驟

試劑配置:

硫酸水溶液(25%):將25 mL硫酸轉(zhuǎn)移至含有50 mL純水的100 mL容量瓶中。用純水稀釋至刻度線并混勻。

酸性溴化鈉水溶液(600 g/L):稱取 60 g溴化鈉,加水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,加入3.5 mL 25%硫酸溶液,用水定容至刻度,混勻。

酸化氯化鈉水溶液(200 g/L):稱取 20 g 氯化鈉,加水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,加入3.5 mL 25%硫酸溶液,用水定容至刻度,混勻。

氫氧化鈉-甲醇溶液(0.35 mol/L):稱取1.4 g氫氧化鈉,加入甲醇溶解,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,混勻,轉(zhuǎn)移至塑料瓶中,儲(chǔ)存于10℃下。臨用現(xiàn)配。

苯硼酸溶液:稱取適量苯基硼酸,溶于無(wú)水乙_醚,配制成飽和溶液,混勻。

乙_醚-石油醚溶液(1+1):量取乙_醚和石油醚各 100 mL,混勻。

乙_醚-乙酸乙酯溶液(6+4):量取 60 mL 乙_醚和 40 mL 乙酸乙酯,混勻。

1%乙二醇溶液:移取 100 µL乙二醇,加乙酸乙酯定容至 10 mL,混勻。


試樣提取:

準(zhǔn)確稱取兩份嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g(精確至 1 mg)于兩支40 mL玻璃螺紋樣品瓶中(A、B管),分別準(zhǔn)確加入100 µL混合內(nèi)標(biāo)工作液(1 µg/mL);加入2 mL 65 ℃±5 ℃水,渦旋混勻,再加入1 mL氨水,蓋塞渦旋混勻,在65℃±5℃水浴下振蕩30 min,取出后冷卻至室溫。加入3 mL乙醇,渦旋后加入5 mL乙_醚,振搖5 min,然后加入5 mL石油醚,繼續(xù)振搖5 min。待溶液靜置分層后,取上層溶液于40 mL玻璃樣品瓶中;再加入乙_醚和石油醚各5 mL,重復(fù)萃取1次,合并有機(jī)相于40 ℃下氮吹濃縮至干,用2 mL乙_醚-石油醚溶液(1+1)淋洗樣品瓶?jī)?nèi)壁,將洗液轉(zhuǎn)移至8 mL玻璃螺紋樣品瓶中,于40 ℃下氮吹至干,供堿水解。


堿水解(酯鍵斷裂反應(yīng)):

向提取脂肪樣品中加入100 µL甲苯、200 µL叔丁基甲醚(tBME)。渦旋混勻30 s,10°C水浴冷卻7 min。加入200 µL于10℃±1℃下冷卻好的 0.35 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液,渦旋混勻,于10℃±1℃下水解反應(yīng)7 min。結(jié)束后立即于A管、B管中分別加入酸化氯化鈉溶液、酸化溴化鈉溶液各600 µL終止水解反應(yīng),渦旋,放置5 min。

于上述A、B管中和后的水解液中各加入600 µL正己烷,渦旋30 s后,靜置待分層后棄去正己烷液,再加入正己烷重復(fù)萃取一次。若分層不理想,可以2000 r/min的速度離心3 min,下層水相供衍生用。


試樣凈化:

在凈化的水溶液中加入0.5 mL無(wú)水乙_醚-乙酸乙酯(6+4),渦旋10 s,取上層溶液于裝有約0.3 g無(wú)水硫酸鈉的離心管中,渦旋,再加入0.5 mL無(wú)水乙_醚-乙酸乙酯(6+4)重復(fù)萃取操作。


衍生化反應(yīng):

合并2次萃取液,向凈化液中加入30 µL苯基硼酸溶液,渦旋30 s后,加入30 µL 1%乙二醇溶液,渦旋,靜置分層,必要時(shí)可離心使分層徹_底,將溶液轉(zhuǎn)移至裝有約0.3 g無(wú)水硫酸鈉的玻璃樣品瓶中,渦旋混勻10 s,提取液過(guò)0.22 μm的疏水性PTFE針式濾器后供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。


前處理注意事項(xiàng):

1、0.35 mol/L甲醇鈉溶液建議存放在4℃條件下,建議至少存放2h以上,臨用前拿出;

2、10°C低溫酯交換反應(yīng)時(shí)需盡量將整個(gè)螺紋瓶浸泡在水中,以保證螺紋瓶?jī)?nèi)溫度穩(wěn)定;

3、前處理過(guò)程中盡量避免使用塑料耗材,可使用玻璃螺紋瓶、玻璃巴斯德吸管、玻璃移液管、手動(dòng)進(jìn)樣針等耗材,建議進(jìn)行方法空白實(shí)驗(yàn)監(jiān)控過(guò)程本底情況;

4、建議使用疏水性PTFE針式濾器進(jìn)行過(guò)濾;

5、注意區(qū)分AB管,B管加入溴化鈉溶液用于檢測(cè)3-MCPDE和2-MCPDE的含量,A管加入氯化鈉溶液用于校正計(jì)算GE的含量。




4、儀器條件

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀

色譜柱:毛細(xì)管氣相色譜柱CD-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm,貨號(hào):GAEQ-554421)

進(jìn)樣量:2 µL

進(jìn)樣口溫度:300℃

進(jìn)樣模式:不分流進(jìn)樣

載氣:氦氣,純度≥99.999 %

色譜柱流速:1.0 mL/min

程序升溫:70 ℃保持1 min,10 ℃/min升至100 ℃,5 ℃/min升至180 ℃,以25 ℃/min升至320 ℃保持5 min。

傳輸線溫度:320℃     

離子源溫度:280℃

離子化能量:70 eV     

溶劑延遲時(shí)間:8 min

掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM模式),離子對(duì)信息見(jiàn)下表:

表4 目標(biāo)物離子對(duì)信息

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儀器維護(hù)注意事項(xiàng):

1、隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加,儀器輕微污染,目標(biāo)物保留時(shí)間可能發(fā)生偏移;

2、該實(shí)驗(yàn)對(duì)儀器污染比較嚴(yán)重,儀器受到嚴(yán)重污染后,可能導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)降低、分離度變差等情況,需注意儀器的清洗維護(hù),包括進(jìn)樣針的清洗,離子源的清洗,色譜柱的老化等;

3、如儀器配制程序升溫進(jìn)樣口和反沖功能,可明顯降低對(duì)儀器的污染程度。

4、建議色譜柱加裝2m 相同固定相的預(yù)柱,定期對(duì)預(yù)柱進(jìn)行更換,可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。




5、實(shí)驗(yàn)譜圖

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圖1 A管中氯丙醇酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

(標(biāo)線第4點(diǎn) STD-4)

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圖2 B管中氯丙醇酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖(標(biāo)線第4點(diǎn) STD-4)

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圖3 A管中奶粉樣品空白和樣品加標(biāo)的TIC譜圖

(上圖為樣品空白,下圖為樣品加標(biāo)0.20 mg/kg)

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圖4 B管中奶粉樣品空白和樣品加標(biāo)的TIC譜圖

(上圖為樣品空白,中圖為樣品加標(biāo)0.02 mg/kg,下圖為樣品加標(biāo)0.20 mg/kg)




6、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

在加入酸性溴化鈉溶液的B管標(biāo)準(zhǔn)樣品中,以氯丙醇酯的質(zhì)量(以醇計(jì))為橫坐標(biāo),以氯丙醇酯與其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在加入酸性氯化鈉溶液的A管標(biāo)準(zhǔn)樣品中,計(jì)算 3-MCPD 與內(nèi)標(biāo) D5-3-MCPD 的峰面積比值,通過(guò) 3-MCPD 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(B管標(biāo)準(zhǔn)樣品得到)計(jì)算得到A管標(biāo)液中 3-MCPD(由縮水甘油酯標(biāo)品轉(zhuǎn)變而來(lái))的質(zhì)量。以 GE 的質(zhì)量(以縮水甘油計(jì))為橫坐標(biāo),GE 轉(zhuǎn)化后形成的 3-MCPD的質(zhì)量為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)(1/a)即為 3-MCPD 增加量折算成 GE 含量的系數(shù)t。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

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6.2 加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

本次實(shí)驗(yàn)方法空白未檢出氯丙醇酯和縮水甘油酯,奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的本底含量分別為0.040、0.024、0.006 mg/kg。

奶粉樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)下表。

表6 奶粉基質(zhì)的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)(n=3)

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數(shù)據(jù)計(jì)算注意事項(xiàng):

1、本實(shí)驗(yàn)3-氯丙醇酯使用D5-3 -氯- 1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯作為定量?jī)?nèi)標(biāo);2-氯丙醇酯使用D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯作為定量?jī)?nèi)標(biāo);

2、縮水甘油酯最終含量以縮水甘油計(jì),因此其含量不是簡(jiǎn)單的A、B管的3-MCPD差值,需要乘以折算系數(shù);

3、基質(zhì)樣品通常含有本底,回收率均為扣除本底后計(jì)算得到。




7、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

使用安譜實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)耗材,參照國(guó)標(biāo)《GB 5009.191-2024 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氯丙醇及其脂肪酸乙酯、縮水甘油酯的測(cè)定》第二篇第三法,堿水解方法,使用氘代同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,AB雙樣校準(zhǔn)縮水甘油酯含量,3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油脂肪酸酯的回收率在85%-110%之間,RSD小于10%。該方法操作簡(jiǎn)便快速,能夠很好的滿足奶粉基質(zhì)中氯丙醇酯和縮水甘油酯的檢測(cè)。




8、實(shí)驗(yàn)中所用到的耗材

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